Цитологическое и культурологическое экспериментальное обоснование применения имплантатов из биоситалла для замещения дефектов костной ткани

Орлов В.П.1, Дулаев А.К.1, Лысенок Л.Н.2, Пинаев Г.П.3, Николаенко Н.С.3

Военно-медицинская академия 1, Государственный Технологический институт 2, Институт цитологии РАН 3, Россия

Анализ современной литературы, посвященной биоматериалам, применяемым для замещения костных дефектов позволил сделать вывод о том, что имеющиеся в настоящее время имплантаты на основе металлов, сплавов, полимеров, стекла, керамики не обладают достаточными прочностными и остеорепаративными свойствами, кроме того имплантаты из металлов и синтетических полимеров изготовлены из веществ чужеродных для человеческого организма и по химическому составу не соответствуют костной ткани [1, 2, 4-8, 12, 14-17].

Попытки решить проблему замещения костных дефектов с использованием широкопористых имплантатов из биодеградируемых материалов на основе фосфатов кальция и композиций гидроксиапатита со стеклом, как наиболее близких по химическому составу к натуральной кости, большого успеха не имели [3, 9, 10, 11]. Эти материалы кроме слабых прочностных характеристик обладают еще и отсутствием синхронности процессов биодеградации и остеорепарации (разрушение данных имплантатов происходит раньше образования надежного костного блока). По мнению Hitchon P. W. et al. [13], Ryu K. S. et al. [18] изделия из плотных и прочных, биодеградирующих кальций фосфатных (гидроксиапатитовых) материалов препятствуют процессам остеоинтеграции, в результате чего происходит образование капсулы из соединительной ткани на границе с имплантируемым материалом и наблюдается неустойчивость имплантата в структурах скелета.

Целью настоящего исследования явилось изучение свойств стеклокристаллических материалов как наиболее близких по составу натуральной кости.

Материалы и методы

Стеклокристаллические имплантаты из биоситалла изготовленны на кафедре технологии стекла Санкт-Петербургского Государственного Технологического института.

Для определения токсичности биоситаллов, а также чувствительности к ним клеточных структур "in vitro" проведено тестирование пористых биоситаллов М-12 и М-31, основанное на экстракции из них в питательных средах, являющихся аналогами биологических жидкостей, ионов и других микроэлементов, при последующем контроле основных свойств этих питательных сред поддерживать рост и функциональную активность культивируемых в них клеток. В дальнейшем были отработаны условия культивирования остеобластов на биоситалле, а также начат поиск наиболее чувствительных методов, позволяющих контролировать их пролиферацию и дифференцировку. Исследования проводили на базе отдела клеточных культур Института цитологии РАН. В работе использовали клетки яичника китайского хомяка СНО-К1 и клетки остеосаркомы крысы ROS17/2, которые были подвергнуты испытанию с помощью 2-х тестов. В первом тесте изучали клональный рост клеток СНО-К1 в контрольной и опытных средах. Во втором тесте изучали массовый рост и дифференцировку остеобластоподобных клеток ROS17/2 в контрольной и опытных средах.

Исследования биоситаллов "in vivo" проводили в экспериментальной лаборатории ВМедА. Эксперименты были проведены на 17 беспородных собаках с массой тела 10-15 кг (рис.1).

Биоситаллы размерами от 0.2´0.3´0.7 см до 0.5´0.7´1.0 см туго вставляли в гребни подвздошных костей по два имплантата с каждой стороны. Забор материала производили через 1, 3, 6 и 12 месяцев после операции. При заборе материала через указанные сроки новые фрагменты биоситалла имплантировали в оставшиеся интактными участки крыльев подвздошных костей животных (табл. 1).

Таблица 1

Распределение исследованных имплантатов по срокам послеоперационного периода.

Сроки наблюдения, месяцы

М-12

М-31

N 216

Итого

1

8

7

8

23

3

10

9

9

29

6

9

8

8

26

12

8

8

8

25

Всего

35

32

33

103

Фрагмент изучаемого материала резецировали вместе с прилежащим участком костной ткани, затем макропрепарат фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина. Декальцинацию проводили по стандартным методикам в растворе трилона-В. Гистологические шлиф-срезы толщиной 10 мкм окрашивали гематоксилином и эозином по Ван-Гизону. Оценивали гистологические срезы в исследовательском микроскопе "Jenamed-2" (Германия) при увеличении: ´50; ´100; ´200 и ´400. Гистологические исследования проводили на кафедре патологической анатомии ВМедА.

Исследование зоны контакта биоситалла и кости также проводили с помощью метода электронно-зондового рентгеновского микроанализа.

Результаты

Экспериментальное исследование токсических свойств и культурологическое обоснование применения имплантатов из биоситалла. Анализ результатов исследования на токсичность позволил сделать вывод о том, что клональный рост клеток яичника китайского хомяка СНО-К1 и клеток остеосаркомы крысы ROS17/2 в опытной среде (с порошком тестируемых биоситаллов) практически идентичен росту этих клеток в условиях контрольной среды. Следовательно, исследуемые имплантаты из биоситаллов по своему химическому составу не токсичны для чувствительных клеточных систем "in vitro".

В процессе изучения пролиферации и дифференцировки культивируемых клеток остеосаркомы крысы линии ROS17/2 и клеток, полученных из черепа новорожденных крысят, было отмечено, что как нормальные, так и трансформированные остеогенные клетки хорошо прикрепляются к пластинкам из биоситалла М-31 и пролиферируют на их поверхности, давая в течение 5-15 дней индекс пролиферации 5.8-8.5.

Полученные данные свидетельствуют о том, что трансформированные клетки ROS, легко мигрируют с биоситалла и формируют на пластике через 10 дней культивирования монослой, близкий по характеру к контрольным клеткам (рис.2).

Также было отмечено, что диплоидные костные клетки даже через 2 недели культивирования оставались прочно связанными с биоситаллом и не мигрировали на пластик в отличие от контрольных клеток, культивированных на стекле (рис.3).

Дифференцировку нормальных и трансформированных клеток, культивируемых на биоситалле, контролировали по изменению уровня активности щелочной фосфатазы. Трансформированные клетки на биоситалле имели активность щелочной фосфатазы, близкую к контролю, а активность фермента в нормальных клетках на биоситалле выше, чем в контроле.

С целью получения комплексного источника компонентов внеклеточного матрикса и ростовых факторов, было изучено влияние кондиционированной среды на распластывание, пролиферацию, формирование пограничного слоя и функциональную активность нормальных костных клеток на биоситалле. В результате проведенного исследования было установлено, что кондиционированная среда, полученная на стационарной фазе роста клеток снижает пролиферацию клеток и уменьшает их количество в пограничном слое. Такая кондиционированная среда увеличивает активность щелочной фосфатазы и ускоряет минерализацию клеточного пласта. Данные сканирующей электронной микроскопии подтвердили тот факт, что биоситалл, как и кондиционированная среда, способствует формированию минерализованного костного матрикса (рис.4).

Анализ полученных результатов позволил сделать следующие выводы: трансформированные остеобластоподобные клетки остеосаркомы крысы и нормальные клетки, полученные из черепа новорожденных крысят, способны пролиферировать и сохранять черты остеобластной дифференцировки при длительном их культивировании (более 2-х недель) на биоситалле М-31 и М-12; кондиционированная среда, полученная на стационарной фазе культивирования нормальных костных клеток "in vitro", снижает пролиферативную активность этих клеток на логарифмической фазе роста; биоситалл и кондиционированная среда взаимно ускоряют минерализацию клеточного пласта; биоситаллы М-31 и М-12 обеспечивают прикрепление и пролиферацию на своей поверхности остеобластоподобных и нормальных костных клеток, т.е. являются остеокондуктором костной ткани.

Особенности формирования зон контакта биоситалл - кость в эксперименте на животных. При исследовании характера реакции костной ткани на имплантат из биоситалла (N 216, n=8 с объемной пористостью от 10-15% и величиной пор от 40 до 50 мкм) было макроскопически установлено, что через месяц имплантат со стороны мягких тканей был окружен нежной соединительно-тканной капсулой, реакции со стороны раны и окружающих тканей отмечено не было. При исследовании макропрепаратов обнаружено, что имплантат от мягких тканей и кости отделен тонким слоем соединительной ткани различной толщины. При гистологическом исследовании капсула представлена формирующимися коллагеновыми волокнами. Частицы биоситалла окружены тканями, содержащими макрофаги, единичные полиморфно-ядерные лейкоциты, плазмоциты, лимфоциты (рис.5).

Через три месяца вокруг имплантатов из биоситалла (N 216, n=9) выявляли плотную фиброзную капсулу, благодаря которой формировался надежный фиброзный блок. Гистологически в перифокальной соединительной ткани признаков остеогенеза (наличие остеобластов и незрелых костных балок) не отмечали. Межбалочные промежутки по краю дефекта были закрыты волокнистой соединительной тканью (рис.6).

Через 6 месяцев вокруг имплантатов (N 216, n=8) наряду с плотной соединительно-тканной капсулой гистологически выявляли прилежащую к капсуле губчатую кость с утолщенными костными балками и суженными костно-мозговыми пространствами, содержащими преимущественно жировой костный мозг. Микроструктура стенки капсулы изменилась и состояла из пучков зрелых коллагеновых волокон, при этом фиксация имплантата в костном ложе была достаточно надежной.

Через 12 месяцев (N 216, n=8) на границе имплантат-кость в коллагеновой ткани были определены вновь образованные костные пластинки остеоидного характера с участками обызвествления и утолщенные костные балки. Прилежащая к коллагеновой ткани губчатая кость имела выраженное утолщение костных балок (рис.7).

При исследовании характера реакции костной ткани на пористые имплантаты из биоситалла (М-12, М-31, объёмная пористость 40%, величина пор от 75 до 120 мкм) были отмечены следующие закономерности. Через месяц после имплантации животные активны, нагноения ран, а также реакции окружающих тканей в месте имплантации отмечено не было. Макроскопически имплантат от мягких тканей отделен тонким слоем соединительной ткани, при этом в области контакта с костью соединительная ткань отсутствовала.

При гистологическом исследовании на границе между имплантатом и костью обнаружена грануляционная ткань, врастающая в биоситалл с явлениями фрагментации имплантата и макрофагальной реакцией в виде резорбции биоситалла. Клеточная пролиферативная реакция на имплантат выражена слабо. Имплантат удавалось отделить от кости с легким усилием.

Спустя 3 месяца имплантаты (М-12, n=10 и М-31, n=9) в зоне контакта с мягкими тканями были покрыты капсулой из соединительной фиброзной ткани, клеточная реакция отсутствовала. В области контакта с костью образовавшаяся капсула представлена коллагеновыми волокнами с новообразованными костными балками и участками обызвествления. Межбалочные промежутки вдоль границы перекрыты костными пластинками, фиксация имплантата достаточно прочная (рис.8).

После истечения срока в 6 месяцев было отмечено образование прочного костно-биоситаллового блока. Стабильность блока увеличена за счет врастания костной ткани. Через 12 месяцев макроскопические изменения в мягких тканях были аналогичны изменениям, наблюдавшимся после 6 месяцев, а в зоне контакта с костью имплантат был покрыт плотным слоем новообразованной костной ткани (рис.9).

Результаты исследования зоны контакта кость-биоситалл с помощью метода электронно-зондового рентгеновского микроанализа. При исследовании зоны контакта кость-биоситалл (М-12 и М-31) через 3 месяца после имплантации был отмечен плотный контакт шириной 100 мкм. При этом каких-либо промежуточных образований, пустот и других следов конфликта имплантатов с костной тканью выявлено не было. Имплантат окружен плотным слоем новообразованной костной ткани с сохранением в отдельных зонах участков соединительной ткани (рис.10).

Распределение ионов основных элементов кремния, кальция и магния было следующим. Ионы кремния в основном были определены в имплантате, в большом количестве они выявлялись и в пограничном слое, что связано с резорбцией имплантата, а также указывало на то, что исследуемый имплантат относится к биоактивной стеклокерамике (рис.11).

Через 12 месяцев после имплантации был проведен анализ образцов имплантатов. Анализ полученных изображений с учетом их масштаба показал, что контакт имплантата М-12 (объёмная пористость 30%, величина пор 80 мкм) с костным ложем плотный, отсутствуют пустоты, промежуточные образования, коллагеновые или фиброзные волокна. Макроскопически было отмечено формирование костно-биоситаллового блока.

Процесс постепенного замещения имплантата костной тканью наглядно представлен на рисунке 12. На микрофотографиях представлена граница имплантата М-31 с костным ложем. Зона контакта имплантата с костью расширена, определяются области врастания соединительной остеогенетической ткани с элементами образования костной ткани внутрь имплантата. Растровые картины распределения ионов кремния довольно точно повторяют очертания кости и очагов остеогенеза в имплантате. Отмечаются достаточно выраженные изменения содержания различных ионов в зоне контакта имплантата с костным ложем и непосредственно в центре биоситалла.

Анализ результатов проведенных цитологических и экспериментально-морфологических исследований показал, что стеклокристаллические имплантаты (биоситаллы) обладают оптимальными прочностными и остеокондуктивными свойствами, при этом они остеосовместимы и не нарушают процесс регенерации костной ткани. Для образования прочного костно-биоситаллового блока необходимо обеспечить стабильность имплантата на срок не менее 3 месяцев.

Биологический эксперимент показал хорошую переносимость имплантатов (М-12, М-31 и N 216) костной тканью. Образование прочного костно-биоситаллового блока, минимальная реакция на биоситалл со стороны организма, остеокондуктивные и прочностные свойства данных имплантатов делает возможным применение их в клинической практике для замещения дефектов тел позвонков при травмах и заболеваниях позвоночника.

ЛИТЕРАТУРА

  1. Анисеня И.И. Нагноения и переломы порисиых имплантатов // Импланта-ты с памятью формы: Материалы конгресса международной ассоциации SME. - Новосибирск, 1993.
  2. Ардашев И.П. Стабилизация позвоночника пористыми протезами // 2 Международный конгресс "Имплантаты с памятью формы в травматологии и ортопедии". - Новокузнецк, 1993. - С.87.
  3. Берченко Г.Н., Бурдыгин В.Н., Уразгильдеев З.И. и соавт. Коллапан и гидроскиапатитная биокерамика - новый вид аллопластических материалов в травматологии и ортопедии // Материалы Всероссийского съезда травматологов-ортопедов: тезисы докладов. - Санкт-Петербург, 1999. - с. 366.
  4. Вагнер Е.И., Денисов А.С., Скрябин В.Л. Углеродный материал нового поколения в эндопротезировании костей и суставов. - Пермь, 1993. - 64 с.
  5. Грунтовский Г.Х., Дегтярев Э.В., Сак Н.Н. Применение керамики в ортопедии и травматологии // Ортопед Травматол. - 1979. - N 11. - С. 73-74.
  6. Гюнтер В.Э., Итин В.И., Монасевич Л.А. и др. Эффекты памяти формы и их применение в медицине.- Новосибирск, 1992,- 740 с.
  7. Давыдов Е.А., Шаболдо О.П. Протезирование межпозвонковых дисков металлоконструкциями из никелида титана //1 съезда нейрохирургов Российской Федерации: Тез. докл. - Екатеринбург, 1995. - С. 136.
  8. Зильберштейн Б. М., Сизиков М. Ю. Экспериментально-клиническое обоснование применения устройств из пористого никелида титана у больных с позвоночно-спинномозговой травмой // 1 съезда нейрохирургов Российской Федерации: Тез. докл. - Екатеринбург, 1995. - С. 145.
  9. Медведев Е.Ф. Керамические и стеклокерамические материалы для костных имплантатов // Стекло и керамика. - 1993. - N 2.- 18-20.
  10. Хауваш А. Рентгенологическая оценка керамо-спондилодеза // Ортопед. травматол. - 1992. - N 3. - С. 19-21.
  11. Anderson Orjan H., Karlsson Kaj H., Nieme Leif Modelling of the biological behavior of silicate glasses // Kemia-Kemi. - 1990. - Vol. 17, N 10. - P. 975.
  12. Cook S.D., Dalton J.E., Tan E.H. et. al. In vivo evaluation of anterior cervical fusions with hydroxylapatite graft material // Spine. - 1994. - Vol. 19, N 16. - P. 1856-1866.
  13. Hitchon P. W., Goel V., et al. Comparison of the biomechanics of hydroxyapatite and polymethylmethacrylate vertebroplasty in a cadaveric spinal compression fracture model // J. Neurosurg. - 2001. - Vol. 5, N 10. - Р. 215-220.
  14. Imae S., Handa Y., Koyama T. Long-term evaluation of radiographic changes following cervical anterior fusion with hydroxyapatite ceramic spacer // No-Shinkei-Geka. - 1996. - Vol. 24, N 6. - P. 535-540.
  15. Pintar F. A., Maiman D. J., Hollowell J. P. et. al. Fusion rate and biomechanical stiffness of hydroxylapatite versus autogenous bone grafts for anterior discectomy // Spine. - 1994. - Vol. 19, N 22. - P. 2524-2528.
  16. Ragni P., Ala-Mononen P., Lindholm T. S. Spinal fusion induced by porous hydroxyapatite blocks (HA). Experimental comparative study with HA, demineralized bone matrix and autogenous bone marrow // Ital. J. Orthop. Traumatol. - 1993. - Vol. 19, N 1. - P. 133-144.
  17. Rawlings C.E. Modern bone substitutes with emphasis on calcium phosphate ceramics and osteoinductors // Neurosurgery. - 1993. - Vol. 33, N 5. - P. 935-938.
  18. Ryu K. S., Park C. K., et al. Dose-dependent epidural leakage of polymethylmethacrylate after percutaneous vertebroplasty in patients with osteoporotic vertebral compression fractures // J. Neurosurg. - 2002. - Vol. 96, N 1. - Р. 56-61.